Toxikologische Bewertung nanokristalliner Metalllegierungen mit potenziellen Anwendungen im Luftfahrtbereich

May 27, 2024

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 1523 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Entwicklung neuer Legierungskandidaten mit herausragenden Eigenschaften für den Einsatz im Luftfahrtbereich ist eine der Hauptprioritäten der Branche. In diesem Zusammenhang gelten nanokristalline (nc) Legierungen aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften, wie beispielsweise ihrer außergewöhnlichen physikalischen und mechanischen Eigenschaften, als relevante Materialien. Ein weiterer wichtiger Punkt, der bei neu entwickelten Legierungen berücksichtigt werden muss, ist jedoch die potenzielle toxikologische Wirkung, die diese Materialien auf Menschen und andere lebende Organismen haben können. Das Ziel dieser Arbeit war die Durchführung einer vorläufigen toxikologischen Bewertung von drei nc-Metalllegierungen (WCu, WAl und TiAl) in Pulverform, die durch mechanisches Legieren hergestellt wurden, unter Anwendung verschiedener In-vitro-Tests, einschließlich einer Mischung aus W-Cu-Pulvern mit Standardkorngröße in den Experimenten, um Vergleiche anzustellen. Die Auswirkungen der direkten Exposition gegenüber Pulversuspensionen und/oder daraus abgeleiteten Sickerwässern wurden in drei Modellorganismen analysiert, die repräsentativ für die Exposition von Mensch und Umwelt sind (die adenokarzinomische menschliche alveoläre Basalepithelzelllinie A549, die Hefe Saccharomyces cerevisiae und das gramnegative Bakterium Vibrio fischeri). ). Insgesamt liefern die erzielten Ergebnisse neue Erkenntnisse über die möglichen schädlichen Auswirkungen der ausgewählten NC-Legierungen und zeigen, dass nc TiAl aus toxikologischer Sicht der sicherste Kandidat in den getesteten Modellorganismen und -bedingungen ist.

Der erstmals von Gleiter1 eingeführte Begriff der nanokristallinen (nc) Materialien bezieht sich im konkreten Fall von Legierungen auf ein Metall mit einer mittleren Korngröße im Nanometerbereich, wobei dieser Wert unter 100 nm liegt. Die außergewöhnlichen mechanischen, chemischen und physikalischen Eigenschaften dieser Materialien haben die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft auf sich gezogen und daher waren NC-Metalle Gegenstand intensiver interdisziplinärer Forschung2,3,4,5,6. Zu den herausragenden Eigenschaften dieser Materialien zählen ihre außergewöhnlichen katalytischen und thermischen Eigenschaften sowie ihre große Festigkeit, Härte und erhöhte Verschleißfestigkeit7, die alle durch ihre spezifischen strukturellen Eigenschaften gegeben sind. Daher könnte der Einsatz von NC-Legierungen erhebliche Auswirkungen auf jene Sektoren haben, in denen ein Bedarf für den Einsatz von Werkstoffen mit diesen besonderen Eigenschaften besteht, beispielsweise in der Luft- und Raumfahrtindustrie.

In den letzten Jahren wurde die Entwicklung neuer Materialien für Luftfahrtanwendungen aufgrund des starken Wettbewerbs in diesem Bereich als eine der Hauptprioritäten dieses Sektors angesehen8. Daher wurden umfangreiche Forschungsarbeiten zur Bewältigung dieses Problems durchgeführt, wobei der Schwerpunkt auf der Suche nach Materialien lag, die eine Kostensenkung ermöglichen und gleichzeitig eine Verbesserung ihres Verhaltens unter harten Bedingungen (Verschleiß- und Korrosionsbeständigkeit, Schadenstoleranz usw.) ermöglichen9. 10,11. Daher ist die Auswahl der Elemente zur Entwicklung einer neuen Kandidatenlegierung ein entscheidender Schritt, der sorgfältig abgewogen werden sollte. In diesem Zusammenhang ist die mechanische Legierungstechnik, die die Kombination von Elementen ermöglicht, die mit anderen herkömmlichen Verfahren nur schwer oder gar nicht geschmolzen werden können12, als relevante Methode für die Herstellung neuer Legierungen hervorzuheben. Darüber hinaus hat sich bei metallischen Nanomaterialien gezeigt, dass das Legieren den Temperaturbereich, in dem die Vergröberung gehemmt wird, erheblich erweitert, was eine der schädlichen Auswirkungen ist, die diese Materialien haben können, wenn sie ständig hohen Temperaturen ausgesetzt sind4,13,14. In dieser Hinsicht haben mehrere NC-Metalllegierungen im Vergleich zu ihren reinen Metallgegenstücken ein verbessertes Verhalten bei hohen Temperaturen gezeigt15,16.

Neben außergewöhnlichen mechanischen und physikalischen Eigenschaften, die neu entwickelte Legierungen aufweisen sollten, um ihren Einsatz in den gewünschten Bereichen zu ermöglichen, sollte auch ihre Sicherheit für Mensch und Umwelt berücksichtigt werden. Tatsächlich wurde die Toxizität verschiedener relevanter Metalllegierungen, die in verschiedenen Bereichen wie der Biomedizin oder dem Militär (Herstellung medizinischer Geräte, Munitionsherstellung usw.) weit verbreitet sind,17,18 bereits mit In-vitro- und In-vivo-Methoden bewertet19,20,21. 22. Mit dem Aufschwung der additiven Fertigungsindustrie in den letzten Jahren ist die Verwendung von Metallpulvern derzeit jedoch weitaus weiter verbreitet. Da Metallpulver giftiger sein können als ihre Massengegenstücke23, muss die Bereitstellung von Informationen über mögliche Folgen im Zusammenhang mit ihrer Handhabung und Verwaltung als von entscheidender Bedeutung angesehen werden, wobei auch eine mögliche Auswaschung aufgrund ihrer Verschlechterung und Verschlechterung zu berücksichtigen ist.

In dieser Studie wurden drei durch mechanisches Legieren hergestellte binäre Metalllegierungen vom Nanokorntyp mit vielversprechenden Eigenschaften hinsichtlich Leistungsniveau unter extremen Bedingungen und Machbarkeit der Herstellung aus toxikologischer Sicht bewertet. Die folgenden binären Legierungen wurden ausgewählt: eine leichte hitzebeständige hochfeste Metalllegierung für Luftfahrtanwendungen: TiAl; und zwei strahlungsbeständige Metalllegierungen für strahlenabschirmende Weltraumanwendungen: WAl und WCu. Daher wurde die biologische Wirkung der Legierungspulver von nc WCu, WAl und TiAl analysiert, indem verschiedene In-vitro-Tests unter Verwendung von zwei Modellorganismen durchgeführt wurden, die als Vertreter der menschlichen (A549-Zelllinie) und der Umweltexposition (Saccharomyces cerevisiae) ausgewählt wurden. Darüber hinaus wurde die potenzielle Toxizität der von diesen Materialien erzeugten Legierungsauslaugen in der A549-Zelllinie sowie im biolumineszierenden Bakterium Vibrio fischeri untersucht. Eine handelsübliche W-Cu-Pulvermischung mit Standardkorngröße (25 Gew.-% Cu) wurde ebenfalls in die Experimente einbezogen. Insgesamt liefert diese Arbeit vorläufige Informationen über die Sicherheit der verschiedenen NC-Legierungen und liefert wertvolle Daten, die dabei helfen, den am besten geeigneten Kandidaten unter Berücksichtigung ihrer potenziell gefährlichen Eigenschaften zu bestimmen.

Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften und potenziellen Anwendung in der Luftfahrtindustrie wurden in der vorliegenden Studie drei binäre NC-Legierungen für ihre toxikologische Bewertung ausgewählt. Die Eigenschaften verschiedener NC-WAl-Legierungen, einschließlich einer W80Al20, wie sie in dieser Arbeit untersucht wurde, wurden kürzlich beschrieben und zeigten, dass die Zugabe von Al zu einer deutlichen Verbesserung der Vergröberungsbeständigkeit und Sinterbarkeit im Vergleich zu reinem handelsüblichem Wolfram24 führte. Bezüglich nc WCu wurden die Eigenschaften dieser Legierung kürzlich ebenfalls untersucht25. W und Cu sind nicht mischbare Metallsysteme, die durch die Anwendung mechanischer Legierungen legierbar sind und die hervorragenden Eigenschaften von W (hohe thermomechanische und Strahlungsabschirmungseigenschaften) mit denen von Cu (hohe thermische und elektrische Leitfähigkeit) kombinieren12,26. Schließlich ist TiAl eine intermetallische Phase, in der Ti und Al durch stöchiometrische Beschränkungen verbunden sind. Ti-Legierungen werden häufig für die Herstellung von Strukturbauteilen für Flugzeuge verwendet, da sie eine außergewöhnliche Festigkeit und Korrosionsbeständigkeit aufweisen8.

Zusammensetzung, Kristallstruktur, Partikelgröße und Auslaugbarkeit sind Faktoren, die die Toxizität von Legierungspulvern beeinflussen können. SEM, XRD und ICP-MS sind für die Bewertung dieser Parameter sehr nützlich. Daher wurden die in dieser Arbeit untersuchten Legierungspulver mithilfe der genannten Methoden charakterisiert. Zunächst wurde die durchschnittliche Kristallitgröße der drei NC-Legierungen (ncWCu, WAl und TiAl) mithilfe der Scherrer-Gleichung berechnet. Diese für nanoskalige Kristallite wirksame Formel basiert auf den XRD-Mustern der mechanisch legierten Pulver (Ergänzungsmaterial, Abb. S1, S2, S3). Die durchschnittliche Korngröße jeder Probe ist in Tabelle 1 dargestellt, was zeigt, dass die drei untersuchten NC-Legierungen ähnliche Werte aufwiesen.

SEM und SEM EDX wurden jeweils verwendet, um die Elementzusammensetzung aller Legierungspulver (Gew.-%) zu visualisieren und zu analysieren, einschließlich derjenigen aus der WCu-Probe (Standardkorngröße) (sWCu). Da bei der Herstellung der Proben Kohlenstoffklebeband verwendet wurde, wurden in allen Proben niedrige Prozentsätze an C (≤ 8 %) sowie geringe Prozentsätze an O festgestellt, was auf einen geringen Oxidationsgrad in der Oberfläche hinweist. Zusätzlich zu diesen Elementen wurden in den Proben geringe Mengen anderer Elemente nachgewiesen, die mit den Materialien der verwendeten Mahlmittel in Zusammenhang stehen, wie etwa Ni oder Fe. Da diese Probe durch die Mischung der Pulver der beiden Elemente hergestellt wurde, erwies sich das sWCu erwartungsgemäß als heterogen. So wurden verschiedene W- und Cu-Partikel nachgewiesen und auch durch Rasterelektronenmikroskopie unterschieden (Abb. 1). In Bezug auf ncWCu betrugen die nachgewiesenen Prozentsätze von W und Cu 59,13 % ± 1,99 bzw. 26,37 % ± 1,02. Bei WAl- und TiAl-Proben betrugen die Prozentsätze der verschiedenen nachgewiesenen Elemente 89,18 % ± 1,80 % W und 3,78 % ± 0,43 % Al im ersteren und 77,18 % ± 3,24 % Ti und 13,95 % ± 2,23 % Al im letzteren .

Morphologie der Metallpulver. sWCu (A), (E); ncWCu (B), (F); WAl (C), (G) und TiAl (D), (H). Bilder (A), (B), (C) und (D): Originalvergrößerung × 100 (Maßstabsbalken = 100 μm); Bilder (E), (F), (G) und (H): Originalvergrößerung × 500 (Maßstabsbalken = 50 μm).

Die Morphologie der ausgewählten Proben wurde mittels REM analysiert und visualisiert (Abb. 1). In allen Fällen wurde eine Vielzahl von Partikeln mit Größen im Mikrometerbereich, meist von einigen wenigen bis mehreren Dutzend Mikrometern, beobachtet. TiAl-Pulver zeigten die größte Partikelgröße (Abb. 1D, H), während WAl-Partikel die höchste Heterogenität aufwiesen (Abb. 1C, G). Hinsichtlich ihrer Form und Morphologie wurden in allen NC-Legierungen vieleckige und runde Partikel unterschieden. Im Fall von sWCu erwiesen sich W-Partikel als abgerundet und bildeten Strukturen, die Aggregaten ähnelten, und waren kleiner als Cu-Partikel, die eckigere Formen aufwiesen (Abb. 1A, E).

Darüber hinaus wurde das Vorhandensein der Elemente, aus denen die ausgewählten Pulver bestehen, in Sickerwässern bewertet, die nach dreimonatiger Inkubation der Materialien in Wasser mit einer Konzentration von 10 g/L erhalten wurden. Die W- und Cu-Gehalte wurden in den sWCu- und ncWCu-Proben analysiert. Die NC-Legierung zeigte höhere Konzentrationen beider Elemente (W: 323.669,15 ppb; Cu: 45.110,10 ppb) im Vergleich zur Probe mit Standardkorngröße (W: 119.101,26 ppb; Cu: 4096,84 ppb). Bei den NC-WAl-Sickerwässern wurden niedrigere W-Werte als in beiden WCu-Proben beobachtet (24.829 ppb) festgestellt, während die nachgewiesene Al-Konzentration niedrig war (136,31 ppb). Schließlich zeigte sich, dass die TiAl-Legierung weniger wahrscheinlich in Wasser auslaugt, da die festgestellten Ti- und Al-Gehalte im Vergleich zu den für die entsprechenden Elemente in den anderen Legierungen gemessenen Werten sehr niedrig waren (Al: 11,27 ppb; Ti: 0,23 ppb).

Zusammenfassend ergaben die physikalisch-chemischen Charakterisierungsanalysen, dass die drei untersuchten NC-Legierungen ähnliche Korngrößenwerte aufweisen, da sie alle aus Partikeln im Mikrometerbereich mit unterschiedlicher Auslaugbarkeit bestehen.

Die A549-Zelllinie wurde als Modell für die menschliche Exposition verwendet, um die möglichen gefährlichen Auswirkungen der NC-Legierungen zu untersuchen. Daher wurde die Lebensfähigkeit dieser Zelllinie nach Einwirkung unterschiedlicher Konzentrationen der Metallpulver sowie die Fähigkeit dieser Materialien, oxidativen Stress auszulösen, bewertet. Die Ergebnisse des Lebensfähigkeitstests, der mit dem Neutralrot-Aufnahmetest analysiert wurde, sind in Abb. 2A dargestellt. Eine statistisch signifikante Abnahme des Prozentsatzes lebensfähiger Zellen wurde beobachtet, nachdem sie 24 Stunden lang 160 und 800 mg/L ncWCu-Pulvern ausgesetzt wurden, was Lebensfähigkeitswerte von ≈ 70 % bzw. ≈ 20 % zeigte. Bei der Probe mit Standardkorngröße wurde nur eine signifikante Abnahme dieses Parameters beobachtet, wenn die Zellen 800 mg/L (≈ 20 %) ausgesetzt wurden. Bei den A549-Zellen, die WAl- und TiAl-nc-Legierungspulvern ausgesetzt waren, wurden keine negativen Auswirkungen auf ihre Lebensfähigkeit beobachtet, was darauf hindeutet, dass beide Materialien für diesen Modellorganismus unter den getesteten Bedingungen sicher sind.

Auswirkungen der direkten Exposition von A549-Zellen gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen der Metallpulver. (A) Lebensfähigkeit von A549-Zellen (Neutralrot-Assay). Die Ergebnisse werden als % der Kontrolle (unbehandelte Zellen) ausgedrückt. (B) Oxidativer Stress (ROS-Spiegel) in A549-Zellen. Die Ergebnisse werden als relativer Fluoreszenzwert im Vergleich zur Kontrolle (unbehandelte Zellen) ausgedrückt, der ein Wert von 1 zugewiesen wurde. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Die Unterschiede wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Dunnett-Post-hoc-Test ermittelt, um jeden Mittelwert mit der Kontrolle zu vergleichen, und bei P ≤ 0,05 als signifikant angesehen. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001.

Die Fähigkeit der ausgewählten Materialien, oxidativen Stress zu induzieren, wurde auch in der A549-Zelllinie anhand des DCFH-DA als Indikator für die ROS-Produktion bewertet (Abb. 2B). Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Produktion von oxidativem Stress in A549-Zellen nach einstündiger Exposition gegenüber ncWCu-Pulvern, wobei die beobachteten ROS-Werte bei den beiden höchsten getesteten Konzentrationen (160 und 800 mg/L) statistisch signifikant sind. Allerdings zeigten Zellen, die sWCu ausgesetzt waren, nur dann statistisch signifikante Werte an oxidativem Stress, wenn sie in Gegenwart von 800 mg/L inkubiert wurden, wobei die ROS-Werte etwa doppelt so hoch waren wie die durch ncWCu induzierten. WAl-Pulver wiederum erhöhten deutlich dosisabhängig die ROS-Werte der A549-Zellen ab 32 mg/l deutlich. Im Gegensatz dazu zeigten TiAl-Pulver unter den getesteten Bedingungen keine Fähigkeit, oxidativen Stress in A549-Zellen auszulösen.

Das toxikologische Potenzial der ausgelaugten Produkte, die nach der dreimonatigen Inkubation der Metallpulver in Wasser erhalten wurden, wurde ebenfalls anhand derselben Tests bewertet, die zur Durchführung der Direktkontakttests verwendet wurden. Wie in Abb. 3A dargestellt, verringerten nur die Sickerwasserkonzentrationen, die 800 mg/L beider WCu-Proben entsprachen, die Lebensfähigkeit der A549-Zellen. Dieser Effekt war bei den Zellen, die ncWCu-Auslaugungen ausgesetzt waren, stärker, was eine Verringerung ihrer Lebensfähigkeit um ca. 30 % aufwies, während sWCu-Auslaugungen einen Rückgang von ca. 10 % verursachten. WAl- und TiAl-Legierungslauge erwies sich unter allen getesteten Bedingungen als sicher. Hinsichtlich ihrer Fähigkeit, oxidativen Stress auszulösen (Abb. 3B), zeigten beide WCu-Sickerwässer, dass sie bei Konzentrationen von 160 und 800 mg/l statistisch signifikante ROS-Werte induzierten. Bei WAl-Sickerwässern wurden signifikante oxidative Stresswerte erst bei Konzentrationen von 800 mg/L beobachtet. Schließlich wurde bei den Direktkontaktbestimmungen für TiAl festgestellt, dass Sickerwasser aus diesem Material bei keiner der getesteten Konzentrationen oxidativen Stress hervorrief.

Auswirkungen auf A549-Zellen, nachdem sie unterschiedlichen Konzentrationen der Pulversickerflüssigkeiten ausgesetzt wurden. (A) Lebensfähigkeit von A549-Zellen (Neutralrot-Assay). Die Ergebnisse werden als % der Kontrolle (unbehandelte Zellen) ausgedrückt. (B) Oxidativer Stress (ROS-Spiegel) in A549-Zellen. Die Ergebnisse werden als relativer Fluoreszenzwert im Vergleich zur Kontrolle (unbehandelte Zellen) ausgedrückt, der ein Wert von 1 zugewiesen wurde. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Die Unterschiede wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Dunnett-Post-hoc-Test ermittelt, um jeden Mittelwert mit der Kontrolle zu vergleichen, und bei P ≤ 0,05 als signifikant angesehen. **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001.

Der weitverbreitete Einsatz von Metalllegierungen in den verschiedensten Bereichen machte deren toxikologische Bewertung erforderlich, wobei unterschiedliche Zelllinien als Modellorganismus eingesetzt wurden. Beispielsweise wurde die Biokompatibilität von Ti-Legierungen, die bei der Herstellung von medizinischen Geräten wie Zahn- oder orthopädischen Implantaten verwendet werden, eingehend untersucht, wobei verschiedene menschliche Zelllinien aus unterschiedlichen Geweben verwendet wurden27. Aus dem gleichen Grund wurde die Toxizität von W-Legierungen mit einer zunehmenden Verwendung in militärischen Anwendungen als Ersatz für Blei in der Munitionsherstellung anhand verschiedener Zelllinien untersucht28. Neben der Zusammensetzung sind Größe und Form wichtige Faktoren, die die inhärente Toxizität einer Legierung entscheidend beeinflussen. Im Fall von Ti beispielsweise zeigten experimentelle Ergebnisse, dass das elementare Pulver dieses Metalls im Wesentlichen zytotoxisch sein kann, während Ti in großen Mengen biokompatibel ist23. Die Autoren erklärten die beobachteten Unterschiede damit, dass die Konzentration der von elementaren Metallen freigesetzten Ionen in das Medium deutlich geringer ist als die von Pulver freigesetzte und somit weniger zytotoxisch ist. In der vorliegenden Arbeit lagen die ausgewählten, untersuchten Legierungen in Pulverform vor und wiesen Partikel im Mikrometermaßstab auf. In Anbetracht ihrer Fähigkeit, die Lebensfähigkeit der Zellen zu verringern und oxidativen Stress zu verursachen, zeigten die Ergebnisse, dass ncWCu die zytotoxischste Legierung ist, während TiAl unter den untersuchten Bedingungen die sicherste ist. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten auch einen Zusammenhang zwischen der Auslaugungsanfälligkeit der Materialien und der damit verbundenen Toxizität: ncWCu war die Legierung, die die höchsten Mengen ihrer Komponenten in den Auslaugflüssigkeiten freisetzte, während TiAl nur sehr geringe Mengen an Ti und Al auslaugte. Darüber hinaus konnten auch die im sWCu-Sickerwasser nachgewiesenen geringeren Cu- und W-Gehalte im Vergleich zu denen im legierten Gegenstück (W- und Cu-Konzentration waren ≈ 3 bzw. ≈ 11-mal höher in ncWCu-Sickerwasser als in sWCu-Sickerwasser) nachgewiesen werden erklären ihre Unterschiede in der Toxizität gegenüber A549-Zellen. In diesem Zusammenhang haben Palombella et al. analysierten das zytotoxische Potenzial von Mikro- und Nanopartikeln aus nullwertigem Eisen, Kobalt und Nickel in menschlichen Fettstammzellen und legten nahe, dass die schädlichen Wirkungen der Mikropartikel durch die Freisetzung von Ionen im umgebenden Medium oder durch deren Anwesenheit verursacht werden könnten dieser Partikel um die Zellen herum, was zu einer Verringerung der Sauerstoff- und Nährstoffaustauscheffizienz führen würde29.

Wenn man bedenkt, dass alle in dieser Arbeit analysierten Sickerwässer, mit Ausnahme derjenigen von TiAl (mit sehr niedrigen Ti- und Al-Konzentrationen), oxidativen Stress und sogar Zelltod verursachen können (im Fall beider WCu-Proben), kann vermutet werden, dass die freigesetzten Ionen eine Rolle spielen eine wichtige Rolle bei der Toxizität der untersuchten Materialien. Da zudem die Intensität der zytotoxischen Reaktion in den direkten Kontaktexperimenten höher war, kann davon ausgegangen werden, dass die beobachteten Effekte durch eine Kombination der freigesetzten Ionen zusammen mit der direkten Interaktion der Zellen mit den Metallpartikeln hervorgerufen werden. In diesem Zusammenhang kann hervorgehoben werden, dass einige Metalllegierungspartikel nachweislich oxidativen Stress verursachen, ohne dass gefährliche Mengen an Ionen an das Medium abgegeben werden müssen30,31.

Das toxikologische Potenzial der NC-Legierungen mit unterschiedlicher Zusammensetzung wurde auch für die Hefe Saccharomyces cerevisiae bestimmt, einen zugänglichen einzelligen Pilz, der häufig als Modell zum Verständnis molekularer Mechanismen in eukaryontischen Zellen32 und auch in ökotoxikologischen Studien33 verwendet wird. Die Lebensfähigkeit von Hefezellen nach Exposition gegenüber zwei verschiedenen Materialkonzentrationen (800 und 8000 mg/l) und Zeiten (2 und 24 Stunden) wurde durch Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) analysiert (Abb. 4).

Koloniebildende Einheiten (KBE) von S. cerevisiae-Zellen, die verschiedenen Metallpulvern bei zwei Expositionszeiten (2 und 24 Stunden) und zwei Konzentrationen (800 und 8000 mg/L) ausgesetzt wurden. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz (%) der KBE ausgedrückt, die für jede Expositionsbedingung bestimmt wurden, wobei als Referenzwert die nicht exponierte Zellbedingung verwendet wurde, der ein Wert von 100 % zugewiesen wurde. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Die Unterschiede wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Dunnett-Post-hoc-Test ermittelt, um jeden Mittelwert mit der Kontrolle zu vergleichen, und bei P ≤ 0,05 als signifikant angesehen. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01.

Bei einer kurzen Expositionszeit (2 Stunden) konnten keine signifikanten Unterschiede in der Lebensfähigkeit von S. cerevisiae zwischen der Kontrollbedingung (nicht exponierte Zellen) und einer der vier bei beiden Konzentrationen getesteten Proben beobachtet werden. Bei einer Verlängerung der Expositionszeit (24 Stunden) konnten jedoch einige Unterschiede in der Lebensfähigkeit zwischen den untersuchten Bedingungen beobachtet werden. Insbesondere wurde eine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit von S. cerevisiae-Zellen in Gegenwart der höheren Konzentration von WAl- und TiAl-Legierungen (P ≤ 0,01 bzw. P ≤ 0,05) über 24 Stunden beobachtet.

Das toxikologische Potenzial der in flüssigen Suspensionen vorhandenen Legierungen wurde ebenfalls ermittelt und ihre Fähigkeit, die Bildung von ROS zu induzieren, untersucht. Auch hier wurden 800 und 8000 mg/L der verschiedenen Metallpulver verwendet, um S. cerevisiae-Zellen zwei Stunden lang freizulegen.

Wie in Abb. 5 gezeigt, waren die Unterschiede in den relativen Fluoreszenzniveaus, die zwischen den S. cerevisiae-Zellen beobachtet wurden, die den unterschiedlichen Legierungen ausgesetzt waren, gering. Bei der höchsten Konzentration wurden die höchsten durchschnittlichen ROS-Werte für WCu- und TiAl-Legierungen beobachtet, sie unterschieden sich jedoch nicht wesentlich von denen, die unter den übrigen getesteten Bedingungen, einschließlich der Kontrollbedingung, beobachtet wurden.

ROS-Induktionsanalyse von S. cerevisiae-Zellen, die 2 Stunden lang verschiedenen Metallpulvern in zwei verschiedenen Konzentrationen (800 und 8000 mg/L) ausgesetzt waren. Die Ergebnisse werden als willkürliche Fluoreszenzwerte ausgedrückt. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Die Unterschiede wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Dunnett-Post-hoc-Test ermittelt, um jeden Mittelwert mit der Kontrolle zu vergleichen, und bei P ≤ 0,05 als signifikant angesehen.

Während die Wirkung von Metallen und Metalloiden auf S. cerevisiae für viele Forscher Gegenstand von Untersuchungen war und Erkenntnisse zu verschiedenen Aspekten der Metallbiologie generierte34, ist wenig über die Wirkung spezifischer Metallkombinationen auf Pilze und andere Mikroorganismen bekannt. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Fähigkeit, durch die verschiedenen Legierungen in S. cerevisiae-Zellen Zellschäden hervorzurufen, selbst in Gegenwart sehr hoher Konzentrationen sehr gering ist. Dies weist darauf hin, dass Faktoren, die die Metalltoxizität in S. cerevisiae beeinflussen, wie etwa die Konzentration, die Artbildung und der Oxidationszustand, bei den untersuchten Legierungen von untergeordneter Bedeutung sind. Aufgrund der geringen beobachteten Toxizität haben wir uns daher entschieden, keine zusätzlichen Analysen mit Legierungs-Sickerwasserlösungen durchzuführen.

Der Einfluss der NC-Legierungen auf das Meeresbakterium V. fischeri wurde durch Überwachung der von diesem Mikroorganismus erzeugten Biolumineszenz in Gegenwart von Sickerwasser, das 160 und 800 mg/L der verschiedenen Materialien entspricht, bewertet. Abbildung 6 zeigt die Entwicklung der von den Bakterien erzeugten Lichtintensität, die über einen Zeitraum von 30 Minuten mit Intervallen von 5 Minuten überwacht wurde. Die Kurven zeigten, dass alle Sickerwässer einen Abfall des anfänglichen Biolumineszenzpeaks um etwa 50 % verursachten, ähnlich dem Abfall, der bei der Hemmungskontrolle (ZnSO4·7H2O) beobachtet wurde. Von diesem Zeitpunkt an blieb die Biolumineszenz in den Bakteriensuspensionen, die WAl- und TiAl-Auslaugungen ausgesetzt waren, konstant, wobei die Lichtintensität mit der der Kontrolle (nicht exponierten Zellen) für beide getesteten Konzentrationen nach 20-minütiger Exposition vergleichbar war. Bei den Bakterien, die mit Sickerwässern inkubiert wurden, die 160 mg/L sWCu entsprachen, war die Entwicklung der Lichtintensität ähnlich wie bei TiAl- und WAl-Sickerwässern beschrieben, während bei einer Konzentration von 800 mg/L eine Abnahme der Biolumineszenz beobachtet wurde. L nach 30 min Inkubation (≈ 40 % weniger Lumineszenz als bei der Kontrolle). Es zeigte sich, dass Sickerwasser aus ncWCu einen entscheidenden Einfluss auf V. fischeri hatte, da die beiden zur Durchführung des Experiments verwendeten Konzentrationen einen Abfall der Lichtintensität hervorriefen, der dem bei der Hemmungskontrolle (ZnSO4·7H2O) beobachteten ähnelte, was zu einem vollständigen Verlust von führte Biolumineszenz.

Einfluss der verschiedenen Metallpulver-Auslaugungen auf die Biolumineszenz von V. fischeri während einer 30-minütigen Exposition.

Aufgrund seiner Einfachheit und schnellen Reaktion sowie der Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit der Tests, in denen es angewendet wird, ist das Meeresbakterium V. fischeri ein nützlicher Organismus zur Untersuchung der Toxizität verschiedener Verbindungen35. Beispielsweise wurde dieser biolumineszierende Organismus zur Bewertung der potenziellen Gefährdung verschiedener Schwermetalle und Mischungen davon36 sowie in Kombination mit anderen Substanzen wie polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen oder Huminsäuren37,38 eingesetzt. In Bezug auf die Exposition von Meeresbakterien gegenüber verschiedenen metallischen Sickerwässern haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass diejenigen, die aus ncWCu stammen und sehr hohe Konzentrationen an Cu und W enthalten, ihre Lichtintensität bei beiden getesteten Konzentrationen drastisch reduzierten. Zuvor wurde berichtet, dass 0,8 mg/L Cu eine fast vollständige Hemmung des von V. fischeri emittierten Lichts nach 2-stündiger Exposition bewirken konnten37. Daher war wahrscheinlich die sehr hohe Konzentration dieses Elements im ncWCu-Sickerwasser die Hauptursache für die beobachteten Effekte. Während Cu und W auch in den aus sWCu-Pulvern gewonnenen Sickerwässern gefunden wurden, waren die Konzentrationen beider Elemente viel niedriger, sodass die Abnahme der Lumineszenz von V. fischeri nur bei der Exposition gegenüber der höchsten getesteten Konzentration beobachtet wurde.

Die potenziellen Auswirkungen, die ein neu entwickeltes Material auf die menschliche Gesundheit und die Umwelt haben kann, sind ein Thema, das in der Entwicklungsphase angemessen berücksichtigt werden sollte. In der vorliegenden Studie wurden drei nanokristalline Binärlegierungen, die aufgrund ihrer anspruchsvollen Eigenschaften unter extremen Bedingungen und der Machbarkeit der Herstellung als vielversprechende Kandidaten für ihren Einsatz in der Luft- und Raumfahrtindustrie gelten, aus toxikologischer Sicht bewertet. Dazu wurden Metallpulver aus WCu-, WAl- und TiAl-nc-Legierungen und die damit verbundenen Sickerwässer in verschiedenen Modellorganismen analysiert. Darüber hinaus wurde eine Pulverprobe mit einer W-Cu-Mischung in Standardkorngröße in die Analysen einbezogen. Im Allgemeinen erwies sich TiAl als die sicherste Legierung, da nur hohe Konzentrationen der Pulver negative Auswirkungen auf Hefezellen hatten, während weder die Sickerwässer noch die Pulver bei den übrigen getesteten Organismen schädliche Auswirkungen hatten, und zwar bei keinem von ihnen die Konzentrationen ausgewertet.

Es scheint ein Zusammenhang zwischen der Toxizität der Legierungen und ihrer Anfälligkeit für die Freisetzung von Elementen in das wässrige Medium zu bestehen. Während aus der TiAl-nc-Legierung, die sich als das sicherste Material der in der vorliegenden Studie getesteten Materialien erwies, nur sehr geringe Mengen an Ti und Al ausgelaugt wurden, zeigte ncWCu eine große Anfälligkeit für Auslaugung und war außerdem das giftigste für A549-Zellen V. fischeri unter den getesteten Bedingungen. Überraschenderweise erwies sich diese Legierung als harmlos für Hefe, wo selbst große Konzentrationen weder zu einer Verringerung ihrer Lebensfähigkeit noch zu oxidativem Stress führten. Insgesamt stellen die präsentierten Ergebnisse eine vorläufige toxikologische Bewertung verschiedener NC-Legierungen dar und weisen darauf hin, dass NC-TiAl aus sicherheitstechnischer Sicht eine gute Kandidatenlegierung für seine Entwicklung und Einführung in der Industrie sein könnte.

Die Synthese von nanokristallinen Legierungspulvern, die in dieser Arbeit zur Durchführung von Toxizitätstests verwendet werden, wurde in den Industrieanlagen von MBN nanomaterialia durch High Energy Ball Milling unter Anwendung einer proprietären mechanochemischen Syntheseprozesstechnologie (Mechanomade®) durchgeführt. Metallpulver in Industriequalität aus W, Al, Cu und Ti wurden im richtigen Verhältnis verwendet, um die angestrebte Zusammensetzung zu erhalten. Die Systeme W50Cu50, Ti75Al25 und W80Al20 wurden hergestellt und in dieser Arbeit als ncWCu, TiAl bzw. WAl bezeichnet. Um die Oxidation des Pulvers so weit wie möglich zu vermeiden, wurde der mechanische Legierungsprozess in einer inerten Ar-Atmosphäre durchgeführt, die auch während der Siebung zur Entfernung größerer Partikel und während der Verpackung beibehalten wurde. Um die Kontamination zu verringern, wurden die Materialien der Mahlkammer und der Mahlkugeln für jede binäre Legierung und jedes Mahlgerät unterschiedlich gewählt. Als Endmaterialien wurden insbesondere folgende verwendet:

W-Cu-System: Bronzekugeln und Hartstahl für die Mahlkammer.

W-Al-System: Hartstahl für die Mahlkammer und die Kugel.

Ti-Al-System: Titan Grad 5 für die Kugeln und harter Stahl für die Mahlkammer.

In den Experimenten wurde auch eine Mischung aus Wolfram- und Kupferpulvern handelsüblicher Qualität (25 Gew.-% Cu) mit Standardkorngröße verwendet. Diese Probe wurde in dieser Arbeit als sWCu bezeichnet.

Die Mikrostruktur der mechanisch legierten Pulverproben wurde mit einem SIEMENS 5005 XRD-Diffraktometer unter Verwendung von Cobalt-Target in den MBN-Nanomaterialia-Einrichtungen charakterisiert.

Die Oberflächenzusammensetzung der in den Toxizitätstests verwendeten Metallpulver wurde mithilfe von SEM-EDX halbquantitativ charakterisiert. In den Einrichtungen der Universität Burgos wurde ein JEOL JSM-6460LV-Mikroskop mit einem energiedispersiven X-MaxN-Detektor eingesetzt, um die Elementidentifizierung und Quantifizierung der Metallpulver durchzuführen. Mindestens drei verschiedene Bereiche wurden zufällig ausgewählt, um die Analyse jedes Materials durchzuführen.

Die Morphologie und die Größe der Partikel wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie sichtbar gemacht und analysiert. Zu diesem Zweck wurde eine kleine Menge jeder Probe direkt mit JEOL JSM-6460LV an der Universität Burgos untersucht.

Es wurden Wassersuspensionen gemahlener Pulver (10 g/l) hergestellt, die in verschiedenen Konzentrationen in den Direktkontaktexperimenten verwendet werden sollten. Vor jedem Experiment wurden die Metallpulvervorräte homogenisiert, indem die Proben 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit verwirbelt wurden, sie einer Ultraschallbehandlung mit geringer Leistungsintensität unterzogen wurden und schließlich ein zusätzlicher Vortex-Schritt durchgeführt wurde.

Die Sickerwässer wurden durch dreimonatige Lagerung von Metallpulversuspensionen (10 g/l) bei 4 °C gewonnen. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert und die Überstände gewonnen und durch 0,22-Polyethersulfon-Membranen filtriert.

Die in den Probensickerwässern vorhandenen Elemente, die nach der Filtration mit 0,2 µm Polyethersulfon-Membranfiltern der wässrigen Fraktion, die aus Metallpulversuspensionen (10 g/L) gewonnen und drei Monate lang inkubiert wurde, gewonnen wurden, wurden durch Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) untersucht ) unter Verwendung eines Agilent 8900 ICP-QQQ-Geräts an der Universität Burgos.

Die Lungenkrebszelllinie A549 wurde in kommerziellem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) und 100 U/ml Penicillin und 100 mg/l Streptomycin, kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer angefeuchteten 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert.

Der Stamm BY4741 von S. cerevisiae wurde in Standard-YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 1 % Hefe-Bactopepton, 2 % Glucose) gezüchtet und gehalten. Zellkulturen in flüssigen Medien wurden auf einem Rotationsschüttler bei 185 U/min und 30 °C inkubiert.

Das biolumineszierende gramnegative Bakterium V. fischeri NRRL B-11177 wurde in Marine Broth oder Agar 2216 bei Raumtemperatur gehalten.

Die Lebensfähigkeit von A549-Zellen, die direkt NC-Legierungspulvern ausgesetzt waren, wurde mithilfe des Neutralrot-Assays bewertet. Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 3 × 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen unterschiedlichen Konzentrationen der Materialien (6,4, 32, 160 und 800 mg/l) ausgesetzt, die in frischem Behandlungsmedium resuspendiert wurden ( DMEM mit 1 % FBS und ohne Antibiotikum). Zellen, die nur mit Behandlungsmedium inkubiert wurden, wurden als lebende Zellkontrolle in die Experimente einbezogen. Nach der Exposition wurden die Vertiefungen mit DPBS gewaschen und 2,5 Stunden lang 100 µL einer Neutralrot-Lösung (40 µg/ml) in jede Vertiefung gegeben. Diese Lösung wurde anschließend verworfen, die Zellen wurden einmal mit DPBS gewaschen und 2 Minuten lang mit 4 % Formaldehyd fixiert. Die Zellen wurden erneut mit DPBS gewaschen und 150 µL einer Farbstofffreisetzungslösung, die 50 % Ethanol 96°, 49 % destilliertes H2O und 1 % Essigsäure enthielt, wurden in jede Vertiefung gegeben. Abschließend wurden die Platten 10 Minuten lang geschüttelt und 100 μl jeder Vertiefung wurden auf eine undurchsichtige Platte mit 96 Vertiefungen übertragen, um die Fluoreszenz mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy HT, Anregungswellenlänge 530/25; Emissionswellenlänge 645/40) zu messen. . Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt (Fluoreszenz der Zellen in Abwesenheit von NC-Legierungen). Es wurden zwei unabhängige Experimente mit jeweils 3 biologischen Replikaten pro Expositionsbedingung durchgeführt. Um die Toxizität der Sickerwässer zu testen, wurden die Zellen 24 Stunden lang unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt (Leckwässer entsprechend 6,4, 32, 160 und 800 mg/l der Legierungen) und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Anwendung des oben erläuterten Protokolls untersucht.

A549-Zellen, die in 96-Well-Platten mit 3 × 104 Zellen pro Well ausgesät wurden, wurden mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Phenolrot gewaschen und anschließend mit einer Lösung von DCFH-DA (2ʹ,7ʹ-Dichlorfluorescin-Diacetat) in HBSS (50) inkubiert µM) für 30 min bei 37 °C im Dunkeln. Nach dieser Zeit wurden die Zellen erneut mit HBSS gewaschen und dann verschiedenen Konzentrationen von in HBSS resuspendierten NC-Legierungspulvern (6,4, 32, 160 und 800 mg/l) ausgesetzt, wobei als Kontrolle Zellen verwendet wurden, die nur mit HBSS inkubiert wurden. Schließlich wurde die Fluoreszenz nach 60-minütiger Inkubation mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek Synergy HT, Anregungswellenlänge 485/20; Emissionswellenlänge 528/20) gemessen. Es wurden zwei unabhängige Experimente mit jeweils 3 biologischen Replikaten pro Expositionsbedingung durchgeführt. Der oxidative Stress, der durch Sickerwasser verursacht wird, das den gleichen Konzentrationen der NC-Legierungen entspricht, die in den Direktkontaktexperimenten verwendet wurden, wurde unter Verwendung des gleichen Protokolls analysiert.

S. cerevisiae-Zellen wurden auf YPD-Medium in einem Orbitalschüttler (30 °C und 185 U/min) vorgezüchtet, bis eine OD600 nm = 1 erreicht war, und dann wurden sie 800 oder 8000 mg/L der verschiedenen Metallpulver in der Probe ausgesetzt Kultur mit dem gleichen Medium oder nicht exponierte Kultur (Negativkontrolle) in 24-Well-Platten (Endvolumen 1 ml). Anschließend wurden Kulturproben nach 2 und 24 Stunden Exposition entnommen. Um die KBE zu beiden Probenahmezeitpunkten zu bestimmen, wurden 100 µl Zellen bei einer Exposition von 2 Stunden 104-fach und bei einer Exposition von 24 Stunden 105-fach verdünnt, auf Platten mit festem YPD-Medium (6 % Agar) inokuliert und bei inkubiert 30 °C für 48 Stunden.

Der CM-H2DCFDA-Farbstoff wurde zur Quantifizierung der intrazellulären ROS-Spiegel in Hefe verwendet, wobei ein Protokoll verwendet wurde, das dem zuvor von James et al.39 beschriebenen ähnelte und kürzlich von unserer Forschungsgruppe40 angepasst wurde. Kurz gesagt, S. cerevisiae-Zellen, die in der exponentiellen Phase wachsen, wurden pelletiert, gewaschen und mit CM-H2DCFDA (7 µM) in DPBS 60 Minuten lang bei 30 °C und 185 U/min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen erneut gewaschen, in YPD resuspendiert und 2 Stunden lang den verschiedenen Proben (800 und 8000 mg/L) ausgesetzt. Dann wurden die Hefezellen zweimal mit DPBS gewaschen, 2 Minuten in einer Lösung mit 2 M Lithiumacetat inkubiert, gewaschen und erneut 2 Minuten in einer Lösung mit SDS (0,01 %) und Chloroform (0,4 %) inkubiert. Die Zellen wurden schließlich pelletiert und der Überstand auf eine schwarze undurchsichtige 96-Mikrotiterplatte übertragen, wo die Fluoreszenz mit einem Mikroplattenlesegerät (Synergy-HT, BioTek) gemessen wurde (Anregungswellenlänge 485/20; Emissionswellenlänge 528/20).

Der Einfluss der Pulversickerwässer, entsprechend 160 und 800 mg/L, auf die von V. fischeri erzeugte Lumineszenz wurde mithilfe des Biolumineszenz-Inhibitionstests untersucht. Kurz gesagt, eine 5-ml-Kultur von Marine Broth 2216, die mit einer lumineszierenden Kolonie beimpft war, wurde 48 Stunden lang bei 15 °C inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde dann zentrifugiert und das Pellet in 5 ml NaCl 2 % (Gew./Vol.) resuspendiert und vor Beginn des Experiments 30 Minuten lang bei 10 °C vorinkubiert. 90 µl Sickerwasser, resuspendiert in 2 %iger NaCl-Lösung in den oben angegebenen Konzentrationen, wurden in jede Vertiefung einer undurchsichtigen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Nicht exponierte Bakterien, resuspendiert in 2 % NaCl, wurden als Kontrolle in den Test einbezogen, um die natürliche Lichtschwächung dieses Mikroorganismus zu überwachen, während mit ZnSO4·7H2O bei 219,8 mg/L inkubierte Bakterienzellen als Lichtinhibitionskontrolle einbezogen wurden. Zur Durchführung des Experiments wurden 10 µL der Bakteriensuspension in jede Vertiefung gegeben und die Platte in einem Thermomixer (800 U/min, 15 °C) inkubiert. Die Lumineszenz jeder Probe wurde in 5-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 30 Minuten in einem Mikroplattenlesegerät (Synergy-HT, BioTek) aufgezeichnet, wobei der Ausgangspunkt der Wert war, der unmittelbar nach der Zugabe der Bakterien gemessen wurde.

Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Es wurde die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) verwendet, gefolgt von einem Dunnett-Post-hoc-Test, um Vergleiche zwischen jedem Mittelwert und der Kontrolle herzustellen. Statistische Tests wurden mit Prism 6.0 (GraphPad Prism, GraphPad Software, Inc.) durchgeführt, wobei die Unterschiede bei P ≤ 0,05 signifikant waren.

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Diese Arbeit wurde von den EU-Horizont-2020-Projekten ICARUS (H2020-FETOPEN-2014-2015-RIA, Fördervereinbarung Nr. 713514) und ICARUS-INAS (FETOPEN-03-2018-2019-2020, Fördervereinbarung Nr. 946174) gefördert. Wir danken Dr. Gréta Gergely und Dániel Pethõ von der Universität Miskolc für die freundliche Bereitstellung der WCu-Pulver und für ihre unschätzbare Unterstützung.

Internationales Forschungszentrum für kritische Rohstoffe – ICCRAM, Universität Burgos, Plaza Misael Bañuelos s/n, 09001, Burgos, Spanien

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CR und JATR konzipierten die Studie. CR und JATR führten die Experimente durch. CR, JATR, AB, AML, RB und SMM analysierten und interpretierten die Daten. CR hat den Originalentwurf geschrieben. JATR, AB und AML waren am Schreiben beteiligt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Carlos Rumbo oder Juan Antonio Tamayo-Ramos.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 29. Oktober 2021

Angenommen: 11. Januar 2022

Veröffentlicht: 27. Januar 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-05406-5

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